443143416貨號：A103-5
規格：500rxn（1.0 ml×5支）
保存：-20℃避光保存兩年
【產品概述】
本產品是采用探針法進行Real Time PCR（qPCR）檢測的試劑。核心組分是基于化學法修飾的熱啟動DNA聚合酶，配合針對qPCR優化的反應緩沖液，實現了對PCR抑制物耐受性高、擴增特異性高、擴增效率高、檢測靈敏度高等特點。本產品是2×濃度的Premix型試劑，配制qPCR反應體系十分簡便。同時，本產品使用UDG酶和dUTP有效防止PCR產物的交叉污染，數據更準確。使用時只需加入模板、引物、探針和水，使其工作濃度為1×，即可進行反應。此外，本產品適用于快速PCR，可以在寬廣的動態范圍內對靶基因進行準確定量，檢測重復性好，可進行可信度高的Real Time PCR分析。
本品特點：使用化學法修飾的熱啟動酶，提高靈敏度，增強特異性；使用dUTP和UDG酶，可有效排除先前擴增產物的交叉污染，數據更準確；針對qPCR優化的反應緩沖液，增強特異性，減少引物二聚體形成，提高擴增效率，重復性好，可信度高。
本品不含有用以校準孔間熒光信號差異的ROX Reference Dye，適用于Bio-Rad iCycler CFX96，CFX384，iQ，iQ5，MyiQ，Opticon, Opticon 2，MiniOpticon，Chromo4，Qiagen Corbett Rotor-Gene Q，Rotor-Gene 3000，Rotor-Gene 6000，Eppendorf Mastercycler ep realplex， realplex 2s，Roche Applied Science LightCycler 480，Thermo Scientific PikoReal Cycler，Illumina Eco qPCR，Cepheid SmartCycler，Takara TP-800等機型。以下機型：Applied Biosystems 7000，7300，7700，7900，7900HT，7900HT Fast；StepOne，StepOnePlus等需要添加高濃度ROX Reference Dye。這些機型：Applied Biosystems 7500，7500 Fast，ViiA7；Stratagene MX3000P，MX3005P，MX4000等需要添加低濃度ROX Reference Dye。
【推薦qPCR反應體系（以20 μl體系為例）】
| Component | Volume | Final ?Concentration |
| 2×qPCR Master Mix(Probe Method) | 10 μl | 1× |
| 10 μM Forward Primer | 0.4 μl | 0.2 μM |
| 10 μM Reverse Primer | 0.4 μl | 0.2 μM |
| 10 μM Probe | 0.4 μl | 0.2 μM |
| PCR-grade Water | Variable | – |
| Template | Variable | As Required |
| Total Volume | 20 μl | – |
反應體系中各成分的量可根據以下原則進行調整：
反應體系中引物終濃度為0.2μM即可得到較好的擴增效果。當反應性能較差時，引物終濃度可以在0.1 -0.5 μM范圍內進行調整；qPCR靈敏度極高，建立反應體系時加入模板量的準確度對最終結果會有很大的影響。推薦將模板稀釋后加入反應體系中，這樣可以有效提高實驗的重復性；如模板為未稀釋cDNA原液，使用體積不應超過qPCR反應總體積的1/10。
【PCR反應條件】
| Step | Temperature | Duration | Cycles |
| UDG pre-treatment | 25℃ | 3 min | 1 |
| Enzyme activation | 94℃ | 10 min | 1 |
| Initial Denaturation | 94℃ | 3 min | 1 |
| Denaturation | 94℃ | 10 sec | 40-45 |
| Annealing/Extensiona | 60℃ | 30 sec |
- 退火/延伸溫度根據不同的引物和探針需要進行優化，推薦優化的溫度范圍為58℃-65℃。退火/延伸時間請根據您使用的Real-time PCR儀所需要的數據采集最短時間限制自行調整：使用ABI 7700和7900時至少30秒；使用ABI 7000、7300和 7500時34秒。
【注意事項】
- 盡量避免反復凍融，以免酶活下降。如每次使用量較少，推薦分裝后保存
- 使用前請上下顛倒混勻預混液，預混液經混勻瞬時離心后即可使用
- qPCR Master Mix(Probe Method)于-20℃保存時，有時會形成沉淀。在室溫短時間放置后，渦旋混勻即可完全溶解。確保試劑混合均勻后再使用
- 由于本品檢測靈敏度極高，在配制過程中請使用干凈滅菌槍頭、反應管，條件容許的實驗室推薦使用專用的移液器，避免污染
【常見問題與解決方案】
1、陰性對照中有信號產生：
模板或試劑被核酸污染：在進行PCR反應前采取標準的預防措施，以降低污染風險
2、定量PCR無擴增曲線：
- 確認程序中是否設置了信號采集步驟：兩步法擴增程序將信號采集設置在退火延伸階段
- 確認引物是否降解：長時間未使用的引物可能發生降解，合成新的引物，重復實驗
- 模板濃度太低或降解：減少稀釋度，一般未知濃度的樣品按最高濃度進行檢測
3、定量PCR擴增曲線不平滑：
- 信號太弱：提高探針濃度或者優化探針濃度
- 定量PCR反應過程中體積變化：PCR管未蓋嚴導致反應體系蒸發
【備注】
本產品僅供科研使用。在確認產品質量出現問題時，本公司承諾為客戶免費更換等量的合格產品。 在所有情況下，本公司對此產品所承擔的責任，僅限于此產品的價值本身。