染料法定量PCR MIX（2× SYBR qPCR Master Mix）

貨號：A101-5
規格：500rxn（1.0 ml×5支）
保存：-20℃避光保存兩年
【產品概述】
本產品是使用SYBR GreenI 嵌合熒光法進行qPCR的專用試劑。核心組分（包含熱啟動Taq酶，UDG酶， dNTPs， dUTP， Mg2+， SYBRGreenI等）是基于化學法修飾的熱啟動DNA聚合酶，配合針對qPCR優化的反應緩沖液，可以有效抑制非特異性擴增，顯著提高擴增效率，從而對靶基因進行準確定量。同時，本產品使用UDG酶和dUTP有效防止PCR產物的交叉污染，數據更準確。本產品為2×預混試劑，使用時只需加入模板、引物、ROX? Reference Dye（根據qPCR儀選擇）和水，使其工作濃度為1×，即可進行反應。
本品特點：使用化學法修飾的熱啟動酶，提高靈敏度，增強特異性；使用dUTP和UDG酶，可有效排除先前擴增產物的交叉污染，數據更準確；針對qPCR優化的反應緩沖液，增強特異性，減少引物二聚體形成，提高擴增效率，重復性好，可信度高；本品不含有用以校準孔間熒光信號差異的ROX Reference Dye，適用于Bio-Rad iCycler CFX96，CFX384，iQ，iQ5，MyiQ，Opticon, Opticon 2，MiniOpticon，Chromo4，Qiagen Corbett Rotor-Gene Q，Rotor-Gene 3000，Rotor-Gene 6000，Eppendorf Mastercycler ep realplex， realplex 2s，Roche Applied Science LightCycler 480，Thermo Scientific PikoReal Cycler，Illumina Eco qPCR，Cepheid SmartCycler，Takara TP-800等機型。
【推薦qPCR反應體系（以20 μl體系為例）】

反應體系中各成分的量可根據以下原則進行調整：
反應體系中引物終濃度為0.2μM即可得到較好的擴增效果。當反應性能較差時，引物終濃度可以在0.1 -0.5 μM范圍內進行調整；qPCR靈敏度極高，建立反應體系時加入模板量的準確度對最終結果會有很大的影響。推薦將模板稀釋后加入反應體系中，這樣可以有效提高實驗的重復性；如模板為未稀釋cDNA原液，使用體積不應超過qPCR反應總體積的1/10。
【PCR反應條件】

【注意事項】

• 本品盡量避免反復凍融，以免酶活下降。如每次使用量較少，推薦分裝后保存
• 使用前請上下顛倒混勻預混液，預混液經混勻瞬時離心后即可使用
• 2×SYBR qPCR Master Mix于-20℃保存時，有時會形成沉淀。在室溫短時間放置后，渦旋混勻即可完全溶解。確保試劑混合均勻后再使用
• 本品含有熒光染料SYBR GreenI，保存以及配制反應體系時應盡量避免強光照射
• 由于本品檢測靈敏度極高，在配制過程中請使用干凈滅菌槍頭、反應管，條件容許的實驗室推薦使用專用的移液器，避免污染

【常見問題與解決方案】
1、陰性對照中有信號產生：
a) 模板或試劑被核酸污染：在進行PCR反應前采取標準的預防措施，以降低污染風險
b) 產生引物二聚體：配合融解曲線進行分析
2、融解曲線出現多個峰：
a) 存在引物二聚體或其他特殊結構：根據設計原則設計合成新的引物
b) 引物濃度太高：適當降低引物濃度
c) cDNA模板帶有基因組污染：重新制備cDNA模板
3、定量PCR無擴增曲線：
a) 確認程序中是否設置了信號采集步驟：兩步法擴增程序將信號采集設置在退火延伸階段
b) 確認引物是否降解：長時間未使用的引物可能發生降解，合成新的引物，重復實驗
c) 模板濃度太低或降解：減少稀釋度，一般未知濃度的樣品按最高濃度進行檢測
4、定量PCR擴增曲線不平滑：
a) 信號太弱：提高模板濃度重復實驗
b) ROX類型使用錯誤：確認所用ROX與機型是否匹配
c) 定量PCR反應過程中體積變化：PCR管未蓋嚴導致反應體系蒸發
5、Ct值出現太晚：
a) 擴增效率低：優化反應條件，或者重新設計合成引物
b) 模板濃度太低：減少稀釋度重復實驗，一般未知濃度的樣品按最高濃度進行檢測
c) 模板降解：重新制備模板，重復實驗
d) PCR產物太長：推薦PCR產物長度為90-200bp
【備注】
本產品僅供科研使用。在確認產品質量出現問題時，本公司承諾為客戶免費更換等量的合格產品。 在所有情況下，本公司對此產品所承擔的責任，僅限于此產品的價值本身。