443143416貨號：A104-5
規格：10T（50μl）×5支
保存：-20℃避光保存兩年
【產品概述】
基于重組原理的無縫克隆技術，作為新一代的克隆方法，不依賴于繁瑣的酶切、回收、連接等操作，通過DNA片段與線性化載體末端的15~25nt同源序列的重組，可將DNA片段克隆至任意線性化載體任意位點，載體自連背景極低。無縫克隆技術是一種簡單、快速、高效的DNA定向克隆技術。Seamless Cloning and Assembly Kit作為升級版的無縫克隆及多片段重組試劑盒，一個反應可實現兩個或多個DNA片段的重組，且陽性率高于95%。
【適用范圍】
基因定向克隆，多片段重組。
【實驗流程】
【ExonArt Seamless Cloning and Assembly試劑盒實驗方案】
1. 線性化載體制備
采用酶切或反向PCR擴增方法將載體線性化。
a. 酶切制備：
選擇合適的位點，單酶切或雙酶切皆可。若使用單酶切進行線性化，可以適當延長酶切時間以減少環狀質粒殘留。酶切完成后，應將限制性內切酶失活或對線性化載體純化后再用于重組反應。
注1 : 載體酶切一定要完全，否則未切開的載體會影響后續陽性克隆的鑒定；
注2 : 經雙酶切進行線性化無需去磷酸化，經單酶切則需要去磷酸化。
b. 反向PCR擴增制備
為減少擴增突變的引入，推薦使用高保真的聚合酶進行擴增。推薦使用線性化質粒做模板，以減少環狀質粒模板殘留對后續陽性克隆的鑒定。
注：如果使用環狀質粒做模板，應使用DpnI對環狀質粒進行降解，再用于后續重組反應。
2. 插入片段PCR引物設計
PCR引物的5′ 端必須包含與其相鄰片段（其他插入片段或載體）末端同源的15~25 nt（推薦使用20 nt）序列。
插入片段正向擴增引物：
5′-載體上游末端同源序列+酶切位點（可選）+基因特異性正向配對序列-3′
插入片段反向擴增引物：
3′- 基因特異性反向配對序列+酶切位點（可選）+載體下游末端同源序列-5′
注：盡量選擇無重復序列且GC含量均勻的區域進行克隆，當酶切位點25 nt區域內含量為40~60%
時，重組效率最高。
- 插入片段PCR擴增
推薦使用高保真的聚合酶進行擴增，以減少擴增突變的引入。建議使用純化后的PCR產物進行重組反應。若PCR產物經瓊脂糖凝膠電泳鑒定為特異性擴增產物，可直接使用，但加樣體積應不超過總反應體積的20%。
- 重組反應：
配制以下反應體系
| 組分 | 反應體系 |
| Seamless Cloning and Assembly kit | 5 μl |
| 線性化載體 | 50~200 ng |
| 插入片段 | 10~200 ng |
| Sterilized ddH2O | 補足至10 μl |
重組反應體系配制完成后，用移液槍輕輕吹打混勻各組分后進行瞬時離心，避免氣泡產生，切勿渦旋。
注1 : 插入片段與載體在重組時為相同摩爾數；
注2 : 若插入片段的長度小于200 bp，則插入片段與載體的摩爾比應調整為5:1；
注3 : 當1~2個DNA片段插入載體時，DNA總量推薦為0.02~0.5 pmols；當4~6個DNA片段插入載體時，DNA總量推薦為0.2~1 pmols；
注4 : DNA摩爾數與質量換算公式：pmols=(weight in ng)×1000/(base pairs×650 daltons) ；例如，200 ng的5000 bp載體為0.06 pmols；
注5 : 載體片段過長、插入片段過長或片段數過多，克隆數及陽性克隆率均會降低。
- 將反應體系置于50℃，反應15~60 min。
注1：推薦使用PCR儀等溫控比較精確的儀器進行反應，反應時間不足或過長均會影響克隆效率；
注2：插入片段小于500 bp時，推薦反應時間為15 min；
注3：插入片段在4 kb以上時，建議反應時間為45~60 min；
注4：插入3~5個片段時，推薦反應時間為45~60 min。
- 重組反應完成后，將反應體系進行瞬時離心，置于冰上冷卻，用于轉化或者凍存于-20℃備用。
注：-20℃凍存的重組產物，建議在1周內使用。
- 重組產物轉化
取5~10 μl重組產物，加入到100 μl感受態細胞中，緩慢吹打混勻，冰上放置30 min。42℃熱激90 sec，冰上放置3 min，加800 μl SOC或LB培養基，37℃振蕩培養45~60 min。將菌液均勻涂布在含有對應抗生素的平板上，倒置于37℃過夜培養。
注：不同感受態細胞最后的克隆數及克隆陽性率有所差別，推薦使用轉化效率大于108 CFU/μg的感受態細胞。
【常見問題】
1.轉化效率低：感受態效率低下；DNA片段純度不夠；重組反應抑制物；DNA片段比例不佳。
2.克隆陽性率低：載體線性化不完全；相同抗性質粒污染；平板抗性不足。
3.大量克隆含有不正確的插入片段：非特異性PCR擴增產物。
【備注】
本產品僅供科研使用。在確認產品質量出現問題時，本公司承諾為客戶免費更換等量的合格產品。 在所有情況下，本公司對此產品所承擔的責任，僅限于此產品的價值本身。