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    2. 重組腺相關病毒包裝

      服務簡介:
      腺相關病毒(adeno-associated virus,AAV)是簡單的非病原單鏈DNA,需要輔助病毒(通常為腺病毒)參與復制。它編碼兩個末端的反向重復序列(ITR)中的cap和rep基因。ITRs對于病毒的復制和包裝具有決定性作用。cap基因編碼病毒衣殼蛋白, rep基因參與病毒的復制和整合。AAV能感染多種細胞。rep基因產物存在時,病毒DNA很容易整合到人類第19號染色體。
      重組腺相關病毒載體(rAAV)源于非致病的野生型腺相關病毒,由于其安全性好、宿主細胞范圍廣(分裂和非分裂細胞)、免疫源性低,在體內表達外源基因時間長等特點,被視為最有前途的基因轉移載體之一,在世界范圍內的基因治療和疫苗研究中得到廣泛應用。經過10余年的研究,重組腺相關病毒的生物學特性已被深入了解,尤其是其在各種細胞、組織和體內實驗中的應用效果方面已經積累了許多資料。在醫學研究中,rAAV被用于多種疾病的基因治療的研究(包括體內、體外實驗);同時作為一種有特點的基因轉移載體,還廣泛用于基因功能研究、構建疾病模型,制備基因敲除鼠等方面。
      愛科博生物采取的三質粒共轉染系統進行重組腺相關病毒的包裝服務,包括從實驗設計到載體構建、病毒包裝、生產、純化、質量鑒定等全套服務,為基礎研究、臨床研究的廣大科研客戶提供高純度、高質量、高滴度的重組腺相關病毒。

      AAV特點:
      1 安全性高:迄今從未發現野生型AAV?對人體致病,重組?AAV?基因組序列上去除了大部分的野生型?AAV?基因組元件,進一步保證了安全性;
      2 免疫原性低:AAV2的基因組僅?4681?個核苷酸,便于用常規的重組?DNA技術進行操作,而且進行動物實驗時造成的免疫反應??;
      3 宿主范圍廣:能感染分裂細胞和非分裂細胞;
      4 表達穩定:能介導基因的長期穩定表達;
      5 物理性質穩定:在60℃不能被滅活,能抗氯仿;

      AAV載體不同血清型

      研究發現?AAV?具有多種血清型,各種不同血清型的?AAV?載體的主要區別是衣殼蛋白不同,因此對不同的組織和細胞的轉染效率存在差異。目前愛科博生物在包裝腺相關病毒時有9種不同的?AAV?血清型可供客戶選擇,建議客戶針對不同組織器官選擇相應血清型的?AAV?病毒,見下表。

      不同血清型AAV對各組織器官細胞的親和性

      血清型 組織親和性
      AAV2 中樞神經,肌肉,肝臟,腦組織,眼,
      AAV5 肺,眼,中樞神經,關節滑膜,胰腺
      AAV8 肝臟,眼,中樞神經,肌肉
      AAV9 心臟,肌肉,肺(肺泡),肝臟,中樞神經

      服務價格及周期:

      編號 表達基因或shRNA 滴度 價格 周期
      AAV-001 表達基因(<2K) 1×1012 VG 3600元 2~3周
      AAV-002 其他 詢價 2~3周
      AAV-003 表達基因(2K~3K) 1×1012 VG 3600元 2~3周
      AAV-004 其他 詢價 2~3周
      AAV-005 表達shRNA(單條) 1×1012VG 3600元 2~3周
      AAV-006 更高滴度 詢價 2~3周
      AAV-007 表達shRNA(驗證三條,保證至少一條有效,包裝一條) 1×1012 VG 6800元 2~3周
      AAV-008 更高滴度 詢價 2~3周

      客戶須知
      1、默認情況下,我們提供1ml腺相關病毒~1×1012vg/ml。
      2、通常小鼠肌肉注射的用量為1×1010~3×1011vg之間,中等劑量是1×1011vg左右;
      3、我們將采取分步收費的方式,即按照所提供的構建,包裝及純化的一系列不同的服務,根據客戶的實際需要,對每項服務進行具體的核算。腺相關病毒包裝服務—— 穿梭載體:pAAV-MCS vector,pAAV-hrGFP vector,pAAV-IRES-hrGFP vector。包裝細胞:AAV293。
      4、本公司目前不提供致癌基因及毒基因等對人體有危害的基因的包裝服務。
      5、如客戶所需包裝的目的基因由客戶提供,則客戶應提供所要構建腺病毒的目的基因的序列及其它相關說明信息??蛻魬獙λ峁┑牟牧霞靶畔⒇撠?,如因客戶提供的材料及信息不準確而引起的實驗延誤或經濟損失由客戶承擔。
      6、包裝好的產品批量儲存的最佳條件為-80°C。
      服務承諾:
      1、默認情況下,本公司包裝的病毒只提供PCR檢測和轉染后的熒光照片結果,如果需要其他結果,客戶根據自己的需要可以自行選擇;
      2、插入穿梭載體目的基因的測序報告,對于需要包裝病毒的客戶,將提供初步純化的病毒液5×1012顆粒數/ml的病毒1ml以上,如客戶需要純化病毒,我們將根據與客戶達成的協議提供1012-13顆粒數/ml以上的純化后的病毒液,并附上一份QC報告;
      3、公司為實驗室研究者提供可用于細胞和動物實驗的研究級AAV病毒載體的構建和制備服務,客戶在24-36個工作日內獲得>1014 vg 的AAV病毒載體。

      附:腺相關病毒包裝和滴度測定流程

      1?表達基因用腺相關病毒包裝載體準備:

      編號 服務描述 服務周期
      1 客戶選擇目的基因、穿梭載體,AXYBIO公司負責實驗設計 1–2 周
      2 客戶提供目的基因,或從AXYBIO cDNA庫中購買該基因 1周
      3 將目的基因的CDS 區構建至穿梭載體上 2 – 3 周

      2?表達shRNA 用腺相關病毒包裝載體準備:

      編號 服務描述 服務周期
      1 客戶選擇靶基因或目的shRNA、穿梭載體, AXYBIO公司負責實驗設計 1 – 2 周
      2 將目的shRNA 構建至穿梭載體上 2 – 3 周
      3 有效shRNA 篩選(三條shRNA,保證至少一條shRNA干擾效率在70%以上) 3 – 4 周

      3?質粒準備和轉染

      (1)質粒的混合(以轉染10 cm培養皿為例)
      將3種質?;旌嫌?.5 ml滅菌管中,加Special H2O至總體積為50 μl,混合比例根據上面實驗結果得出。
      (2)加50μl 10× CaCl2至上述1.5 ml滅菌管中,并加水補足500μl。
      (3)在裝有500μl 2×HeBs的管中逐滴加入CaCl2與DNA的混合溶液(此過程要求在一分鐘內完成),加入的同時在振蕩器上振蕩或用移液器吹打溶液。
      (4)混合物于室溫下靜置5min。
      (5)將混合物(1 ml)分散逐滴加入培養皿中(10 cm皿中10 ml細胞培養基)。
      (6)放入培養箱過夜培養,培養條件37℃ 5%CO2。
      (7)觀察細胞。此時細胞應該長成單層,并在熒光顯微鏡下觀察轉染效率,轉染效率應該在90%以上。
      (8)更換培養基,加入10ml DMEM+2% FBS 培養基37℃ 10%CO2?培養過夜。

      4?收集病毒

      轉染48小時后,用槍頭把293A細胞吹打下來,連同細胞培養上清一起收集到15ml離心管中,1000g離心5min,取上清,-80℃保存;沉淀的細胞重懸于1ml PBS中,-80℃/37℃反復凍融3次,10000g離心10分鐘,取上清,-80℃保存。

      5?測定病毒滴度(熒光顯微鏡計數)

      (1)滴度測定前,以0.5×105濃度種細胞AAV-293于24孔板,每孔1 ml細胞培養基,過夜(12 h)培養使細胞在板底部形成單層,此時細胞密度大約為1.0×105。
      (2)取10 μl病毒液+90 μl培養基,依次稀釋得到10-1至10-8病毒稀釋液。24孔板依次加入梯度稀釋的待測病毒樣品20 μl,留一孔作為對照不加病毒,培養2天。
      (3)熒光計數:熒光顯微鏡下計數帶有熒光的細胞數目
      (4)計算病毒滴度:熒光細胞數目×稀釋倍數(10、102…108)/接種病毒量

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